【貨號】 BC-C-HU-008

【規(guī)格】 1*10⁶個/T25培養(yǎng)瓶（或凍存管）

【保存】 液氮保存，長期

【產(chǎn)品介紹】

【操作步驟】

【細(xì)胞復(fù)蘇】

1、取出1mL凍存管后，迅速放入37℃水浴鍋中不斷搖晃使其解凍，直至凍存管中無結(jié)晶（此過程盡量在2min內(nèi)完成）；

2、準(zhǔn)備15mL離心管，加入2-6mL完培，將凍存管中的細(xì)胞懸液移至離心管，1000 rpm離心3~5min；（比較難養(yǎng)的細(xì)胞可適量增加離心管中的完培）

3、吸棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至無菌的培養(yǎng)器皿中，輕晃動混勻后放入37℃、5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注：復(fù)蘇第二天若細(xì)胞狀態(tài)較好，但漂浮碎片較多可做換液處理；

復(fù)蘇的細(xì)胞需要時間恢復(fù)狀態(tài)，當(dāng)復(fù)蘇好后密度低于80%時，2天內(nèi)暫時不要換液，細(xì)胞生長狀態(tài)恢復(fù)后再進(jìn)行后續(xù)傳代等操作；

【細(xì)胞傳代】

當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%，即可傳代培養(yǎng)。

收集細(xì)胞：貼壁細(xì)胞可以參考以下方法1、吸去培養(yǎng)液，加入不含鈣鎂的PBS，輕輕潤洗瓶底1-2次，吸棄PBS；2、加入0.25%胰酶-EDTA消化液（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），鋪勻瓶底放入培養(yǎng)箱中消化1-2min；（部分細(xì)胞貼壁較牢，可采用分步消化：將消化下來的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管終止，在培養(yǎng)瓶中加入胰酶繼續(xù)消化，直至大部分細(xì)胞脫落）3、倒置顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞變圓脫落，迅速加入完全培養(yǎng)基終止消化，完培與胰酶比例為2:1；4、輕輕吹打細(xì)胞后吸出轉(zhuǎn)移至離心管中。半貼壁半懸浮細(xì)胞需先收集懸液至離心管再參考貼壁細(xì)胞操作。

離心：收集好的細(xì)胞在1000rpm條件下離心3~5min，離心好后棄除上清液。

接種：準(zhǔn)備好新的培養(yǎng)瓶并添加適量完全培養(yǎng)基，在離心管加入1-2mL完全培養(yǎng)基重懸吹打均勻，初次傳代將細(xì)胞懸液按1:2比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，后續(xù)可根據(jù)細(xì)胞實際情況按1:2-1:4的比例傳代；接種完成后放入37℃、5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

懸浮細(xì)胞建議采用半換液傳代：將培養(yǎng)瓶站立靜置5-10min，肉眼可見細(xì)胞沉底，吸取1/2~2/3上清至離心管離心，將瓶內(nèi)剩余懸液按1:2或1:3的比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶，將離心管中的細(xì)胞重懸后放入培養(yǎng)瓶添加新鮮完全培養(yǎng)基即可。

【細(xì)胞凍存】

收集細(xì)胞參考細(xì)胞傳代步驟。

凍存液重懸：細(xì)胞按照傳代步驟收集細(xì)胞至離心管并計數(shù)，根據(jù)計數(shù)的密度決定細(xì)胞凍存數(shù)量，一般推薦細(xì)胞凍存密度為1×10⁶-1×10⁷個活細(xì)胞/管。離心后棄上清，加入配制好的凍存液重懸，分配到凍存管中，每管1mL。

凍存：將凍存管放入程序降溫盒中進(jìn)行梯度降溫，然后放入-80℃冰箱降溫，24h后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐中。若沒有凍存盒，可于冰箱4℃放置30min，隨后轉(zhuǎn)移至-20℃冷凍2h，接下來將其放于-80℃超低溫冰箱中過夜，最終放置于液氮中以長期保存。

【注意事項】

（1）所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全柜內(nèi)操作，并注意防護(hù)。所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需滅菌后方能丟棄。

（2）若細(xì)胞在操作過程中發(fā)生污染，需對污染的細(xì)胞進(jìn)行滅活方可丟棄。

（3）本庫的細(xì)胞系（株）僅用于科研工作，未經(jīng)許可不得用于其他目的，使用者不得將本庫細(xì)胞系（株）轉(zhuǎn)讓給第三者。

（4）細(xì)胞到貨后建議在前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)用。